Comportamento di cellule osteoblastiche SaOS-2

Introduzione

In questo paragrafo è stato valutato il comportamento di cellule di tipo osteoblastico su superfici in titanio caratterizzate da diverse finiture.

In particolare, in questo lavoro, il comportamento cellulare e’ stato valutato sulle seguenti tipologie di superfici:

  1. Superficie sabbiata e sottoposta trattamento di doppio attacco acido. Questo tipo di trattamento e’ stato ampiamente studiato in letteratura ed applicato nella pratica clinica. E’ considerato un golden standard sia per le eccellenti proprieta’ dimostrate che per la vastissima letteratura che ne descrive l’effetto sul comportamento di varie tipologie di cellule osteogeniche (codificato SABBIATO + ACIDATO nel resto di questa relazione)
  2. impianto sabbiato e sottoposto a trattamento da parte del Dr. Lorenzon. (codificato LORENZON nel resto di questa relazione)
  3. come controllo, sono state eseguite valutazioni su dischetti con superficie macchinata.

Le valutazioni eseguite, come descritto in dettaglio nella sezione seguente, sono state:

  • osservazione al SEM di cellule SaOS-2 in crescita sulle diverse tipologie di superficie
  • misure di espressione genica, realizzata con la tecnica di RT-PCR, valutando alcuni geni-chiave del processo osteogenico.

Questa misura ci dice come la macchina genica delle cellule ha risposto agli stimoli costituiti dal contatto con la  superficie e con il terreno di crescita. In funzione di questi stimoli, la cellula “accende” (up-regola) i geni che  impartiscono i comandi per sintetizzare una data proteina. La misura consiste nell’isolare l’RNA messaggero prodotto dalla cellula, “retrotrascriverlo” a DNA, e valutare quanto di esso corrisponde alla porzione di DNA (gene)  di interesse per il sistema in esame. In questo caso sono stati presi in considerazione i geni che presiedono alla produzione di collagene  I,  fosfatasi  alcalina,  osteocalcina,  sialoproteina  e  proteina  morfogenetica  dell’osso-2 (BMP-2).  Inoltre,  e’ stata analizzata l’espressione del  gene RunX2, implicato nel processo di differenziazione cellulare.

Materiali e metodi

I materiali sperimentali erano costituiti da dischetti in Titanio, di 5 mm di diametro. In particolare

erano presenti le seguenti tipologie, come gia’ discusso nel punto precedente:

  • superficie sabbiata + acidata
  • superficie sabbiata + trattamento Dr. Lorenzon
  • superficie macchinata

I test hanno previsto la valutazione dell’adesione cellulare mediante SEM a 5 giorni e la misura RT- PCR a 3, 5 e 10 giorni. Sono stati eseguiti secondo le seguenti metodiche:

Adesione cellulare

Le  cellule  utilizzate  per  la  prova  di  adesione  prove  sono  cellule  di  tipo osteoblastico  da osteosarcoma umano; in particolare, si tratta delle cellule della linea SaOS-2. Le prove di adesione cellulare sono state condotte secondo i protocolli contenuti nella bibliografia internazionale.

Risultati

Osservazione al SEM
Gli aspetti salienti delle indagini SEM sono riassunti nelle figure 1-7 (superficie macchinata), 8-13 (superficie  sabbiata  + acidata), 17-25 (superficie sabbiata + trattamento Lorenzon). Le immagini sono state realizzate dopo 5  giorni di crescita. Per ogni gruppo, la prima immagine e’ a basso ingrandimento (200 x)  le altre  illustrano  osservazioni eseguite  a  1000, 3000 e  5000 x, come riportato in basso nell’immagine. Partendo dalla superficie  macchinata, e’ possibile osservare il tipico aspetto estremamente appiattito delle cellule: come descritto nella letteratura scientifica in materia, il grande appiattimento e l’elevata densita’ cellulare sono indicatori tipici di un fenotipo poco differenziato nella direzione osteoblastica. Si noti come in qualche immagine sia ancora visibile, pur in un quadro di alta densita’ cellulare, la sottostante superficie macchinata.

Dal punto di vista morfologico le cellule cresciute sulla superficie sottoposta a trattamento di sabbiatura  ed  acidatura  (Fig.  8-13)  hanno  un  comportamento  nettamente  diverso  rispetto  alle precedenti: esse infatti si  presentano a 5 giorni con forma piu’ arrotondata e minore densita’. In questo  caso  e’  ben  visibile  la  topografia  della  superficie,  con  la  caratteristica  rugosita’  delle superfici sottoposte a questo tipo di trattamento.

La  crescita  cellulare  sulla  superficie  sottoposta al  trattamento del  Dr.  Lorenzon dimostra una densita’ molto  elevata, al punto che in nessuna immagine e’ possibile osservare la topografia originale, contrariamente agli altri  campioni analizzati. Le cellule non presentano la morfologia appiattita   e   fibroblastoide   di   quelle   cresciute   sulla   superficie   macchinata,   ma   crescono vigorosamente  in  strati  multipli. Da  queste  osservazioni e  da  altre  non  riportate,  e’  possibile concludere  che  la  densita’  superficiale  di  cellule  e’  maggiore  in  questo  caso,  indice  di  una verosimile superiore velocita’ di crescita.

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Misure RT-PCR

Nelle valutazioni di espressione genica sono stati valutati:

  • Collagene I (Coll I) considerato un marker precoce della differenziazione osteogenica
  • Fosfatasi Alcalina (ALP), questo gene controlla la produzione di fosfatasi alcalina, cioe’
  • l’enzima utilizzato per ottenere la parte minerale della costruenda matrice ossea.
  • RunX2, un gene legato alla differenziazione cellulare.
  • Il gene che controlla la sintesi di Osteocalcina (OCN).
  • Il gene che controlla la produzione di proteina morfogenetica dell’osso-2 (Bone Morphogenetic Protein-2, BMP-2), membro della famiglia dei Transforming Growth Factors, e potente stimolatore dell’osteogenesi.
  • Il gene che controlla la sintesi di Bone Sialo Protein (BSP) una glicoproteina altamente specifica del tessuto osseo.
  • Il gene relativo a c-myc, che ha molti compiti ed e’ attivo in diversi processi, inclusa la differenziazione cellulare.
  • Il gene che controlla la sintesi di RANKL, molecola attiva nei processi di riassorbimento e che quindi gioca un ruolo nel rimodellamento osseo.

I risultati ottenuti hanno fornito le seguenti indicazioni:
Innanzitutto, e’ stata effettivamente osservata una diversa espressione genica sullesuperfici analizzate. E’ stato quindi confermato un effetto delle caratteristiche di superficie sulla differenziazione cellulare. I dati ottenuti, riportati nelle figure 26-28, indicano l’espressione di un dato gene rispetto a quanto osservato sulla superficie macchinata. In generale, diversi geni-chiave sono sovraespressi sulla superficie con trattamento Lorenzon, gia’ a tre giorni. Indubbiamente, per ogni tempo sperimentale, questa superficie presenta una maggiore espressione relativamente ai geni analizzati.
Questo dato, combinato all’osservazione di una maggiore densita’ cellulare sul medesimo tipo di superficie, indica una maggiore attivita’ cellulare, in senso osteoblastico, per questa tipologia di finitura.

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Conclusioni

Dai risultati di questo lavoro emerge che le diverse procedure di preparazione delle superfici

influenzano in modo significativo l’interazione delle cellule SaOS-2 analizzate con il substrato in titanio. In particolare, l’interazione con la superficie provoca una significativa sovraespressione di alcuni geni chiave per l’attivita’ osteogenica sulla superficie sottoposta al trattamento del Dr. Lorenzon. La medesima superficie e’ quella che presenta, dopo 5 giorni di crescita, una maggiore densita’ cellulare, unita’ ad una morfologia non appiattita e diversa da quella osservata sulla superficie macchinata.

La superficie del Dr. Lorenzon quindi, nei limiti della presente sperimentazione in vitro, presenta condizioni decisamente idonee alla promozione dell’osteogenesi all’interfaccia impianto/osso.

MINERALIZZAZIONE CELLULARE

A distanza di 5 giorni il campione Lorenzon è stato sottoposto a colorazione per evidenziare depositi di Ca e P

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L’analisi EDX conferma lo spettro della composizione dei depositi evidenziati

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