Comportamento di cellule mesenchimali umane
Introduzione
In questo paragrafo viene valutato il comportamento di cellule mesenchimali umane su impianti in
titanio caratterizzati da tre diverse superfici in titanio. Una sottoposta alla sabbiatura semplice, la seconda SLA e la rterza iperossidata secondo l’autore.
Le cellule mesenchimali umane sono una popolazione di cellule multipotenti localizzate all’interno del midollo osseo, e giocano un ruolo fondamentale nel processo di osteointegrazione. Esse infatti migrano dal midollo osseo al sito di impianto e presiedono alla generazione di nuovo tessuto osseo periimplantare. I meccanismi che inducono la differenziazione osteogenica delle cellule mesenchimali non sono ancora stati del tutto chiariti; un ruolo chiave e’ giocato dall’influenza di stimoli chimici (fattore di crescita ß3, insulina, etc.,). Ad esempio, quando le cellule mesenchimali sono coltivate in vitro in presenza di sali di acido ascorbico, ß-glicerofosfato, glucocorticoidi sintetici come il dexametasone, assumono un fenotipo osteoblastico e secernono una matrice extracellulare in cui viene successivamente depositato fosfato di calcio in forma di cristalli di idrossiapatite.
Tra gli stimoli che possono indurre la differenziazione osteoblastica delle cellule mesenchimali rientrano anche quelli eventualmente esercitati dalla topografia e dalla composizione chimica della superficie implantare. L’effetto puo’ essere sia diretto (ad es. un’eventuale azione della topografia superficiale sulla morfologia e comportamento cellulare) sia indiretto (ad es. una data superficie implantare puo’ adsorbire dall’ambiente esterno proteine o, in generale, biomolecole che promuovono la differenziazione cellulare).
Lo studio dell’evoluzione della differenziazione verso il fenotipo osteoblastico di cellule mesenchimali su superfici di titanio puo’ quindi fornire un interessante modello in vitro dei processi che presiedono alla rigenerazione ossea nel sito periimplantare.
Confrontandone il comportamento su diverse tipologie di superfici implantari e’ possibile valutare come le superfici in esame supportino e assistano la differenziazione cellulare indotta comunque dal terreno di coltura.
Materiali e metodi
I materiali sperimentali erano costituiti da impianti in titanio monofasici, di dimensione 5 x 23. In particolare erano presenti le seguenti tipologie:
– impianto sabbiato (codificato SABBIATO nel resto di questa relazione)
– impianto iperossidato, cioe’ la tipologia precedente sottoposta a trattamento dal dr. Lorenzon
(codificato LORENZON nel resto di questa relazione)
– impianto con superficie SLA. Questa tipologia e’ stata ottenuta sottoponendo a trattamento di doppio attacco acido l’impianto sabbiato. La superficie SLA, utilizzata dagli impianti Straumann, e’ considerata un golden standard sia per le eccellenti proprieta’ dimostrate che per la vastissima letteratura che ne descrive l’effetto sul comportamento di varie tipologie di cellule osteogeniche (codificato SABBIATO + ACIDATO nel resto di questa relazione).
Per ogni tipologia sono stati forniti 18 impianti. Il test ha previsto tre tempi sperimentali, ad ogni tempo sono state eseguite le seguenti misure:
n. 2 impianti dischetti per tipo per test RT-PCR
n. 2 impianti per tipo per la misura di fosfatasi alcalina
n. 2 impianti per tipo per valutazione dell’attivita’ cellulare mediante misura MTT
[Le cellule utilizzate per la prova sono cellule mesenchimali da midollo osseo umano normale (HMSC)]
La purezza della linea cellulare e la capacita’ di differenziarsi in direzione osteogenica, condrogenica e adipogenica sono state verificate mediante citometria di flusso.
Risultati
Misure RT-PCR
1. Valutazione di espressione genica
Sono stati valutati
2. Collagene I (Coll I) considerato un marker precoce della differenziazione osteogenica
3. Fosfatasi Alcalina (ALP), questo gene controlla la produzione di fosfatasi alcalina, cioe’
l’enzima utilizzato per ottenere la parte minerale della costruenda matrice ossea
4. RunX2, un gene legato alla differenziazione cellulare
5. (OCN) Il gene che controlla la sintesi di Osteocalcina
6. Il gene che controlla la produzione di proteina morfogenetica dell’osso-2 (Bone Morphogenetic Protein-2, BMP-2), membro della famiglia dei Transforming Growth Factors, e potente stimolatore dell’osteogenesi
7. Il gene che controlla la sintesi di Bone Sialo Protein (BSP) una glicoproteina altamente specifica del tessuto osseo
8. Il gene relativo a ICAM, una proteina di adesione presente sulla parete cellulare.
I risultati ottenuti hanno fornito le seguenti indicazioni:
Innanzitutto, e’ stata effettivamente osservata una diversa espressione genica sulle superfici analizzate. E’ stato quindi confermato un effetto delle caratteristiche di superficie sulla differenziazione cellulare. I dati ottenuti sono riportati nelle tabelle sottostanti, una per ogni tempo sperimentale. In queste tabelle, il simbolo – significa che l’espressione di un dato gene, riportata a quanto ottenuto sulla superficie sabbiata, non e’ significativamente diversa (l’espressione misurata e’ 1 ± 0.5 rispetto a quella sulla superficie sabbiata); + significa che il gene e’ espresso piu’ di 1.5 volte rispetto a quanto misurato sulla superficie sabbiata; ++ significa che il gene e’ espresso 3 o piu’ volte rispetto a quanto misurato sulla superficie sabbiata. I dati sono i seguenti:
Da un punto di vista qualitativo, i dati si possono commentare come segue:
– a 24 h dall’introduzione degli stimoli osteogenici, non si osservano differenze significative tra le superfici. Solo il gene che codifica per la proteina di adesione ICAM risulta marginalmente piu’ espresso sulla superficie SLA (sabbiata + acidata).
– a 8 giorni, si osservano importanti differenze. Le superfici Lorenzon e quella sabbiata +
acidata esprimono significativamente di piu’ RunX2, indice di differenziazione e, soprattutto, BMP-
2 e BSP. La superficie Lorenzon ha anche elevata espressione della proteina di adesione ICAM.
– a 17 giorni, la superficie sabbiata + acidata e’ simile a quella sabbiata, mentre la superficie
Lorenzon mantiene una sovraespressione di RunX2, Osteocalcina (OCN), BMP2 ed ICAM.
Come si possono interpretare questi dati? E’ sicuramente ragionevole affermare che sia Lorenzon che sabbiata + acidata esercitano un’azione di stimolo a livello cellulare superiore rispetto a quanto fatto dalla superficie sabbiata. In questo senso, quindi, queste due tipologie di trattamento devono essere considerate migliorative, nell’ambito dei limiti di un test in vitro, rispetto alla superficie sabbiata di partenza.
L’azione delle superfici non si esercita tanto a livello del tipico marker fosfatasi alcalina (ALP), che non e’ mai diverso sulle superfici analizzate probabilmente perche’ la sua regolazione e’ controllata dalla stimolazione osteogenica presente nel mezzo di coltura. Piuttosto, l’azione della superficie avviene, in questo modello sperimentale, soprattutto a livello di incrementata espressione di BSP e BMP-2.
Questi risultati sono in pieno accordo con quanto riportato, con analogo modello sperimentale, dalla letteratura del settore1. In particolare, BSP e’ necessaria per la differenziazione osteoblastica e la mineralizzazione. E’ stato riportata che l’espressione di BSP da cellule di questo tipo e’ predittiva della formazione di osso in vivo2. BMP-2 e’ un potente fattore osteogenico e l’aumentata espressione di BSP e BMP-2 suggerisce una maggiore produzione di osso ed un aumento della superfici di contatto osso impianto in vivo.
Passando agli aspetti quantitativi, la figura seguente rappresenta il dettaglio del dato ottenuto a 8 giorni:
Il grafico rappresenta quanto sopra riportato, con BSP espressa 3 o piu’ volte su Lorenzon e sabbiata + acidata rispetto a solo sabbiata e sovraespressione anche di BMP-2 dalle medesime superfici. Quantitativamente, la superficie sabbiata + acidata esprime anche di piu’ rispetto alla superficie Lorenzon, a questo tempo sperimentale. E’ pero’ difficile dire se questa ulteriore sovraespressione ha un’implicazione clinica reale, mentre e’ sicuramente corretto affermare che le due superfici si dimostrano piu’ attive verso le cellule che la superfici sabbiata, come discusso in precedenza.
Le figure successive, in cui il confronto e’ limitato a sabbiata Vs Lorenzon, a 8 e 17gg, indicano in modo molto chiaro che il trattamento di iperossidazione eseguito migliora le caratteristiche della superficie sabbiata, provocando la sovraespressione di geni di diretto interesse per la formazione di osso all’interfaccia tessuto-impianto:
La diminuita differenza in espressione di BSP a 17 giorni puo’ essere spiegata con il fatto che, avendo questa proteina ormai eseguito il suo compito sulla superficie Lorenzon, l’espressione del gene relativo viene fisiologicamente ridotta. In ogni caso, anche a 17 giorni la superficie Lorenzon mantiene un profilo di attivita’ genica nettamente piu’ favorevole rispetto a quello della superficie sabbiata. Piu’ difficile stabilire i rapporti con la superficie sabbiata + acidata a 17 giorni, i cui dati quantitativi sono i seguenti:
Si ricorda che la soglia di significativita’ e’ attorno a 1.5 fold expession. BMP-2 e’ sicuramente piu’ espressa su Lorenzon, mentre a 8 giorni lo era su acidata + sabbiata che quindi potrebbe aver “spento” prima questo gene, perche’ gia’ espresso in abbondanza. E’ quindi difficile stabilire una superiorita’ effettiva dell’una o dell’altra superficie, a questo tempo, rimane l’indicazione che entrambe si comportano molto bene, in modo migliorativo rispetto alla superficie sabbiata.